Auflösungsschub für Mikroskope

  • 11. December 2018

Verspiegelte Objektträger ermöglichen deutlich schärfere Bilder.

Die Schärfe von Lichtmikroskopen ist aus physika­lischen Gründen begrenzt: Struk­turen, die näher beiein­ander liegen als 0,2 Mikro­meter, ver­schwimmen inein­ander – sie lassen sich nicht mehr von­ein­ander unter­scheiden. Ursache dieser Unschärfe ist die Beugung, sie sorgt dafür, dass Licht­strahlen sich nicht beliebig fein bündeln lassen. Jedes punkt­förmiges Objekt wird daher nicht als Punkt, sondern als Fleck abge­bildet. Mit mathe­ma­tischen Methoden lässt sich das Auf­lösungs­ver­mögen dennoch deut­lich ver­bessern. Dazu berech­net man aus der Hellig­keits­ver­tei­lung des Flecks sein exaktes Zentrum. Das funktio­niert aber nur, wenn zwei nah benach­barte Punkte des Unter­suchungs­objekts zunächst nicht gleich­zeitig, sondern nach­ein­ander sicht­bar sind, und erst später in der Bild­bear­bei­tung zusammen­ge­führt werden. Durch diese zeit­liche Ent­kopp­lung wird eine Über­lage­rung der Flecken ver­hindert. Forscher in den Lebens­wissen­schaften nutzen dieses Ver­fahren seit einigen Jahren zur super­hoch­auf­lösenden Licht­mikro­skopie von Zellen.

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Abb.: Konventionelle (links) und spiegel­ver­stärkte dSTORM-Bilder (rechts) eines ein­zel­nen NPC-Rings. (Abb.: JMU)

Eine Variante dieses Verfahrens, das an der Uni Würz­burg in der Arbeits­gruppe von Markus Sauer ent­wickelt wurde, ist die dSTORM-Methode. Hierfür werden bestimmte Struk­turen – zum Beispiel eine Pore eines Zell­kerns – mit fluores­zie­renden Farb­stoffen ange­färbt. Jedes der Farb­stoff-Mole­küle blinkt in unregel­mäßigen Abständen auf und reprä­sen­tiert einen Teil der Pore. Das Bild der kom­pletten Kern­poren ist also zunächst nicht sicht­bar, sondern ent­steht erst nach der Bild­bear­bei­tung durch die Über­lage­rung mehrerer tausend Bilder.

Mit dem dSTORM-Verfahren lässt sich die Auflösung eines herkömm­lichen Licht­mikro­skops um den Faktor zehn steigern. „Dadurch ist zum Beispiel die Archi­tek­tur einer Zelle bis auf Molekül-Niveau sicht­bar“, erklärt Hannah Heil aus der Gruppe von Katrin Heinze am Rudolf-Virchow-Zentrum der Uni Würz­burg. Sie konnte die Methode nun zusammen mit ihren Kolle­ginnen und Kollegen noch einmal ent­schei­dend ver­bessern: Mit Hilfe eines ein­fachen Tricks ist es ihnen gelungen, die Auf­lö­sung nahezu zu ver­doppeln. Dazu bedampften sie ein Deck­glas, auf dem die Zelle während der Beob­ach­tung liegt, mit einer dünnen spie­gelnden Nano­beschich­tung, die aus Silber und trans­pa­rentem Silizium-Nitrit bestand. Die Beschich­tung ist bio­kompa­tibel, schädigt also die Zelle nicht. Mit dieser Methode erzielten die beiden Arbeits­gruppen zwei Effekte: Einer­seits reflek­tierte der Spiegel das von der Pore aus­ge­strahlte Licht zurück zum Mikro­skop, wodurch sich die Hellig­keit des Fluores­zenz­signals erhöhte und somit eben­falls die effek­tive Bild­schärfe.

Dazu kommt ein zweites Phänomen: Die ausgestrahlten und die reflek­tierten Licht­wellen über­lagern sich. Dadurch ent­stehen Inter­ferenzen. Dabei wird je nach Ent­fer­nung zum Spiegel das Licht ver­stärkt oder abge­schwächt. „Auf diese Weise sehen wir vor allem Struk­turen in einer bestimm­ten Bild­ebene“, sagt Heil. „Alles was sich darüber oder darunter befindet und das Bild even­tuell stören könnte, wird dagegen aus­ge­blendet.“ Damit genau die gewünsch­ten Bild­teile sicht­bar werden, muss die Dicke der auf den Spiegel auf­ge­brachten trans­pa­renten Lage passend gewählt werden. Heinze und Heil nutzen unter anderem Computer-Simu­la­tionen, um die Beschich­tung je nach Objekt maß­zu­schneidern.

Insgesamt sei die Methode erstaunlich leicht anzu­wenden, betont Heil. Und Heinze ergänzt: „Abge­sehen von dem beschich­teten Träger, dessen Her­stel­lung kaum etwas kostet, benötigt man keine zusätz­liche Mikro­skopie-Hard­ware oder Soft­ware, um die Auf­lö­sung zu steigern. Das Ver­fahren ist also ein fantas­tisches Add-On für die moderne Mikro­skopie.“

JMU / RK

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