Rote Fluoreszenz in zwei Schritten

  • 22. September 2017

Zweistufiger Farbwechsel­mechanismus bei fluores­zierenden Proteinen geklärt.

Am Anfang stand eine Beobachtung, die Wissen­schaftler der Tech­nischen Hochschule Zürich ETHZ vor zwei Jahren mit einem speziellen fluores­zierenden Protein machten, dem aus Korallen iso­lierten Dendra-2. Es fluores­ziert grün. Mit Licht kann man die mole­kulare Struktur des Proteins so verändern, dass es seine Farbe zu Rot wechselt. Die Forscher fanden damals einen zweiten, neuen Weg für diesen Farb­wechsel: Man regt es zuerst kurz mit einem blauen Laserpuls an und bescheint es sofort danach mit Nah-Infrarot-Licht. Dieses zwei­stufige Farb­umschalten kann unter anderem in der Fluoreszenz­mikroskopie angewandt werden, um in einem Gewebe einen drei­dimensional präzise defi­nierten Punkt, beispiels­weise eine einzige Zelle, sichtbar zu machen.

Abb.: Eine veränderte Form des Proteins Eos kann mit blauem und rotem Laserlicht zum Fluoreszieren gebracht werden. Das in Rot sichtbare Protein wurde mit der neuen, veränderten Eos-Form markiert. (Bildmontage: M. A. Mohr et al. / Wiley VCH)

Abb.: Eine veränderte Form des Proteins Eos kann mit blauem und rotem Laserlicht zum Fluoreszieren gebracht werden. Das in Rot sichtbare Protein wurde mit der neuen, veränderten Eos-Form markiert. (Bildmontage: M. A. Mohr et al. / Wiley-VCH)

Ein interna­tionales Forscher­team unter der Leitung von Periklis Pantazis hat diesen zwei­stufigen Farbwechsel­mechanismus nun aufgeklärt. Das neue Wissen ermöglicht den Forschern, andere Proteine, die auf Licht reagieren, so zu verändern, dass auch sie in zwei Stufen angeregt werden können. Sie unter­suchten die mit blauem Licht akti­vierten Proteine besonders genau und konnten dabei zeigen, dass sich diese Proteine in einem ange­regten Zustand befinden, der mehrere Milli­sekunden anhält. „Das ist verhältnis­mäßig lang“, erklärt Pantazis, „andere Fluoreszenz­phänomene haben eine um ein Vielfaches kürzere Dauer.“

Ebenfalls konnten die Wissen­schaftler zeigen, dass es sich bei diesem Zustand um ein in der Quanten­chemie bekanntes Phänomen, einen Triplett-Zustand handelt. Nach rund fünf Milli­sekunden fällt das Farbprotein Dendra-2 wieder in seinen Grund­zustand zurück. Zum Farbwechsel kommt es nur, wenn die zweite Stufe, das Bescheinen mit Nah-Infrarot-Licht, innerhalb des Triplett-Zeit­fensters erfolgt. Die Lebens­dauer des Triplett-Zustands hängt stark von der Stabilität des Farb­proteins ab, und diese wiederum ist von der genauen Abfolge der Aminosäuren abhängig. Die Wissen­schaftler veränderten daher bei Dendra-2 die Amino­säure-Sequenz an mehreren Stellen. Dasselbe machten sie bei einem weiteren fluores­zierenden Protein, Eos, das bisher nicht zweistufig angeregt werden konnte. Aus der wissen­schaftlichen Literatur war bekannt, dass diese Stellen für den Triplett-Zustand zentral sind.

Bei all den neuen Proteinen maßen die Wissen­schaftler die Dauer des Triplett­zustands. Bei einigen der getesteten Proteinen verlängerte sich dieser Zustand markant. Auch konnten die Wissen­schaftler das Eos-Protein so verändern, dass es ebenfalls zweistufig akti­vierbar wurde. Dasselbe gelang ihnen bei weiteren sechs, bisher nicht zwei­stufig aktivier­baren Proteinen. „Die verän­derten Proteine sind nicht nur erstmals zweistufig schaltbar, auch sind sie stabiler, und als Folge davon leuchten sie stärker“, sagt Manuel Mohr, Doktorand in der Gruppe von Pantazis.

Die ursprüng­liche Entdeckung machten die Wissen­schaftler mit einem nicht-handels­üblichen Laser. Sie verwendeten dazu Licht im Nah-Infrarot-Bereich. Mittler­weile konnten die Wissen­schaftler aber zeigen, dass der Effekt auch mit handels­üblichen Rot-Lasern, wie sie in jedem Fluoreszenz­mikroskop verbaut sind, zustande­kommt. Das heisst, diese Konversion ist mit jedem Fluoreszenz­mikroskop machbar. Sie kann in der Mikro­skopie verwendet werden, um in einem Gewebe einen eng umris­senen Punkt zu markieren. Dazu lenken die Wissen­schaftler einen blauen und einen roten Laserstrahl so in das Gewebe, dass sich die Strahlen an einem Punkt kreuzen. Nur in diesem Kreuzungs­punkt kommt es zum Farb­wechsel. „Weil weder blaues noch rotes Laserlicht toxisch wirken, eignet sich die Methode hervor­ragend für lebende Organismen“, sagt Pantazis. Auch Anwen­dungen in weiteren Mikroskopie­techniken seien denkbar, darunter in der extrem hochauf­lösenden Mikro­skopie.

„Wir wissen jetzt, wie wir photo­konvertierbare Proteine so verändern, dass wir sie zwei­stufig schalten können“, sagt Pantazis. Dieses Wissen haben die Forscher patentieren lassen. Sie arbeiten mit Protein­experten zusammen, um weitere, in der Mikro­skopie verwendete Farb­proteine entsprechend zu verändern. Kürzlich haben die Wissen­schaftler Proteine so verändert, dass sie licht­gesteuert einen genakti­vierenden Boten­stoff abspalten lassen können, und zwar so, dass die Licht­aktivierung mit zwei Farben erfolgen kann. Forscher könnten nun ein Gewebe so mit Laser bestrahlen, dass sich ein blauer und ein roter Strahl an einem Punkt kreuzen. Damit ließen sich gezielt Gene in einer einzelnen Zelle des Gewebes aktivieren. Ausserdem lassen sich auch Proteine, die Kalzium detektieren, ent­sprechend verändern. Diese könnten in der 3D-Hirnkar­tierung einge­setzt werden.

ETHZ / JOL

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