Hochauflösende Kombination

  • 24. May 2017

Neue Mikroskopiemethode vereinigt Lichtscheiben-Mikroskopie und kohärente strukturierte Beleuchtungsmikroskopie.

Ist es möglich, auf der Zellebene zuzusehen, wie sich Fischembryonen zu Forellen, Karpfen oder Lachsen entwickeln? Forschern der Goethe-Universität Frankfurt ist dies gelungen, indem sie eine spezielle Form der Fluoreszenz­mikroskopie mit einer zweiten Mikroskopier­technik kombiniert haben. Das neue hoch­auflösende Licht­mikroskop erlaubt faszinierende Einblicke ins Zellinnere. Bereits mit der von Ernst Stelzer entwickelten Lichtscheiben-Mikroskopie ließen sich Organismen sehr präzise und plastisch bei der Ausdifferenzierung ihrer Zellen beobachten. Nun hat seine Gruppe an der Goethe-Universität das Verfahren mit einer Technik kombiniert, die bisher nur Oberflächen abbildete. Dadurch ließ sich die Auflösung beträchtlich erhöhen.

Abb.: Lebende in Agarose eingebette Hefezelle. Von links nach rechts: konventionelle Fluoreszenz, konventionell bearbeitet und csiLSFM. Der Balken hat eine Breite von einem Mikrometer. (Bild: AG Stelzer, U. Frankfurt)

Abb.: Lebende in Agarose eingebette Hefezelle. Von links nach rechts: konventionelle Fluoreszenz, konventionell bearbeitet und csiLSFM. Der Balken hat eine Breite von einem Mikrometer. (Bild: AG Stelzer, GU)

Das Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskop (LSFM) gehört zur Gruppe der Fluoreszenz­mikroskope. Dabei werden Zellmoleküle mit fluoreszierenden Markern gekennzeichnet, die ein Lichtstrahl zum Leuchten bringt. Eine Kamera nimmt die drei­dimensionale Verteilung der leuchtenden Moleküle, der Fluorophore, auf. Der Vorteil dieses Verfahrens: Es geht sehr schonend selbst mit so empfindlichen Proben wie Fisch­embryonen um. Ein großer Fortschritt, denn herkömmliche Verfahren, welche die ganze Probe beleuchten, arbeiteten mit einer höheren Licht­intensität und zerstörten dadurch die Farbstoffe und die Zellen in sehr kurzer Zeit.

Ernst Stelzer, Professor am Institut für Zellbiologie und Neuro­wissenschaft und Forschungs­leiter im Exzellenz­cluster „Makro­molekulare Komplexe“ der Goethe-Universität, nimmt mit dem LSFM nicht die ganze Probe auf einmal in den Blick, sondern unterteilt sie in mikrometer­dünne Licht­scheiben, die später zusammengesetzt werden. „Da wir die Zellproben unter möglichst natürlichen Wachstums­bedingungen untersuchen, können wir sehr präzise Ergebnisse erzielen“, so Stelzer. Doch nicht nur statische Abbildungen von Zellen, sondern auch dynamische Veränderungen in der Umgebung oder von Gen­mutationen lassen sich im direkten Vergleich messen.

Bo-Jui Chang, Victor Perez Meza und Ernst Stelzer haben das Verfahren jetzt noch weiter verbessert und mit der kohärenten strukturierten Beleuchtungs­mikroskopie (SIM) kombiniert. Das macht eine extrem hohe Auflösung möglich. Die SIM ist eine Super­auflösungs­technik, die mehrere Bilder erzeugt und sie miteinander kombiniert. Dadurch verbessert sich die Auflösung. Technisch geht man so vor, dass man eine fluoreszierende Probe mit einem ganz bestimmten Beleuchtungs­muster anregt. Die Methode ist auf Oberflächen beschränkt, hat aber große Vorteile. So ist sie beim Anregen der Fluoreszenz nicht zu intensiv, ermöglicht sehr schnelle Aufnahmen und kann mit allen fluoreszierenden Molekülen für die Hoch­auflösung eingesetzt werden.

„In dem neuen Mikroskop, das wir csiLSFM nennen, haben wir das Prinzip von SIM so weiter entwickelt, dass es nicht mehr auf Oberflächen beschränkt ist, sondern auch in ausgedehnten drei­dimensionalen Objekten angewandt werden kann. Dazu lassen wir zwei gegenläufige Licht­blätter miteinander interferieren, und zwar unter einem Winkel von 180 Grad, so dass sie das kleinst­mögliche Interferenz­muster bilden. Wir erreichen damit eine maximale Auflösung von unter 100 Nanometern“, erklärt Ernst Stelzer. Das neue Instrument hat drei Objektiv­linsen. Es arbeitet mit einer flexiblen Steuerung von Rotation, Frequenz und Phasen­verschiebung der perfekt modulierten Lichtscheiben. Bilder vom endo­plasmatischen Retikulum, einem weit verzweigten Membran­netzwerk aus Röhren, Bläschen und Zisternen, in Hefen zeigen, dass die Forscher mit csiLSFM an physiologisch bedeutenden Objekten erfolgreich arbeiten können.

GU / DE

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