Mikro-Shuttles und Laserpulse zur Stoffwechselforschung in lebenden Zellen

  • 17. August 2009

 

Nachweis intrazellulärer Immunprozesse mit hoher Zeitauflösung: Forscher schleusten stoffwechselresistente Mikrokapseln in lebende Zellen ein und setzten deren Inhalt durch Laserimpulse frei.

Unverzichtbar für das Verständnis von Stoffwechselprozessen in Zellen, beispielsweise ihre Immunantwort auf Virus-Infektionen, ist das zeitgenaue Nachvollziehen einzelner Transport- und Umsetzungsschritte der beteiligten Substanzen. Um die Kinetik solcher Prozesse zu beobachten, werden Markermoleküle verwendet, deren Schicksal in den Zellen mit den unterschiedlichsten Nachweismethoden verfolgt wird. Viele dieser Methoden haben jedoch den Nachteil, dass die molekularen Marker nicht in ausreichender Menge in die lebenden Zellen eingeschleust werden können. Andere Präparationsmethoden, bei denen entsprechend höhere Konzentrationen in die Zellen gelangen, beeinträchtigen die Zellfunktionen und somit auch den Ablauf der untersuchten Prozesse.

Zellbiolologen um Sebastian Springer und Biophysiker um Matthias Winterhalter von der Jacobs University verfolgten das Ziel - zusammen mit Wissenschaftlern des Max-Planck-Instituts für Kolloid- und Grenzflächenforschung und weiteren englischen Kollegen - , lebende Zellen möglichst schonend mit definierten Mengen experimenteller Marker zu präparieren. Dann setzten sie diese nachdem sich die Zellen von negativen Präparationseffekten erholt haben im Zellinneren frei . Für die Substanz-Einschleusung entwickelten die Forscher „Miniaturshuttles“ aus speziellen stoffwechselresistenten Kunststofffasern mit eingelagerten Nano-Goldpartikeln und einem Durchmesser von rund zwei Mikrometern, was der Größe eines kleinen Bakteriums entspricht. Hergestellt werden die Kapseln, indem die Kunststofffasern netzartig um einen mineralischen Kern gewickelt werden, der dann durch Säure herausgelöst wird. Die so entstandenen porösen Mikro-Holkugeln können die gelöste Testsubstanz aufsaugen und werden dann versiegelt, indem die Kunststofffasern durch Erwärmen geschrumpft und die Poren so verschlossen werden.

Abb.: Fluoreszenzmikroskop-Bild: Kleiner als ein Zellkern (graues Oval, Mitte) ist das neue Substanz-Mikroshuttle (rot mit Pfeil) direkt “vor Ort” im Inneren einer lebenden Zelle (grün: Endoplasmatisches Reticulum) (Bild: Jacobs University Bremen/Sebastian Springer, Matthias Winterhalter)

Abb.: Fluoreszenzmikroskop-Bild: Kleiner als ein Zellkern (graues Oval, Mitte) ist das neue Substanz-Mikroshuttle (rot mit Pfeil) im Inneren einer lebenden Zelle (grün: Endoplasmatisches Reticulum) (Bild: Jacobs University Bremen/Sebastian Springer, Matthias Winterhalter)

In die lebendigen Zellen gelangen die gefüllten Kapseln mittels Diffusion durch die Zellwände, die vorher durch Elektroporation, eine Art Elektroschockbehandlung, für Partikel dieser Größe durchlässig gemacht wurden. Um die Testsubstanz im Zellinneren freizusetzen, werden die Zellen dann mit einem Infrarotlaser beschossen, der die Zellen nicht schädigt, jedoch die Nano-Goldpartikel in den Kapselwänden in Resonanzschwingung versetzt, so dass sie sich erhitzen und die Kapselwände aufschmelzen.

Zur Validierung der Methode schleusten die Wissenschaftler Mikrokapseln mit künstlichen, Fluoreszenz-markierten Proteinfragmenten in das Innere von flüssig kultivierten, lebenden Nagetierzellen ein, um kontrolliert eine Immunantwort der Zellen, die sogenannte Antigenpräsentation an der Zelloberfläche, auszulösen. Nach dem Freisetzen der Marker durch Laserimpulse konnten die Forscher die Ausbreitung der zellfremden Peptidmarker in der Zelle, ihre Aufnahme durch Protein-Komponenten des Immunsystems, den sogenannten MHC-Proteinen, und ihren Transport an die Zelloberfläche sowie ihren Einbau als Antigene in hoher zeitlicher Auflösung unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.

„Die Mikrokapsel-Methode eröffnet uns völlig neue, aufregende Perspektiven, lebenden Zellen direkt bei ihrer Arbeit „über die Schulter zu schauen“ und auch experimentell in intrazelluläre Vorgänge einzugreifen, ohne dass wir unsere Versuchsobjekte dabei zu sehr stören“, kommentiert Sebastian Springer den Forschungsansatz. „Mit Hilfe der Mikroshuttles können wir beispielsweise versuchen, das Verhalten von Zellen gezielt zu manipulieren, indem wir zellfremde funktionelle Proteine oder auch zellfremde Erbinformation einschleusen, um auf vergleichsweise einfachem Weg eine genetische Umprogrammierung zu erreichen.“

Matthias Winterhalter sieht darüber hinaus auch methodisches Potenzial, Stoffe nicht nur schonend in Zellen hinein zu transportieren, sondern auch gezielt in winzigsten Mengen zu extrahieren: „Wenn wir magnetische Nanoparikel in die Kapselwände einbauen, können wir die Shuttles als Miniaturprobengefäße in die Zellen schicken, sie dann in den Zellen verschließen und über einen Magneten zurückholen, um ihren Inhalt zu analysieren. Auf diese Weise kann man die Eigenschaften und Inhaltsstoffe einer einzigen Zelle mit hoher Präzision untersuchen. Dies ist besonders wichtig, wenn nur geringste Probenmengen zu Verfügung stehen, wie beispielsweise in manchen medizinischen Forschungszusammenhängen oder bei der Entwicklung von effizienten, automatischen Hochdurchsatzanalyseverfahren in der Industrie. Wir arbeiten bereits an einer automatisierten Lösung für alle nötigen Arbeitsschritte“, so Winterhalter.

Jacobs University Bremen, Kristin Beck/KP

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KP

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